Sequencing Basics
从组织到数字
理解一个生物样本如何变成 reads、FASTQ、比对记录、特征矩阵与论文 Figure，并在每一步区分测量质量、独立样本和生物学证据。
学完这一章，你应该能够
点击勾选不是“完成任务”，而是对自己的理解做一次承诺。
测序仪没有直接读到疾病，它只读到了文库中的分子
从患者到 Figure 的每一次转换都会选择、压缩或重新定义信息。只有知道当前对象是什么，才能判断结果可以回答哪一层问题。
把样本想成一本书：建库决定复印哪些页，测序仪只看到许多短句，软件再把短句放回参考书，最后统计哪些章节出现得更多。
Sequencing observes library-derived fragments. Base calling, alignment, feature assignment and statistical modeling successively transform signals into inferential objects.
Reads
测序读段
read 是对文库片段的有限长度观测；它可能包含 insert、adapter、barcode、UMI 和错误。
read 是对文库片段的有限长度观测；它可能包含 insert、adapter、barcode、UMI 和错误。
逐 cycle 碱基信号
base caller 将信号转换为 A/C/G/T/N，并为每个碱基估计错误概率。
sequence + per-base quality 的 read 记录
5000 万条 reads 不等于 5000 万个样本
临床研究最常见的统计单位通常是患者、动物或独立培养物；reads、cells 和 spots 往往嵌套在这些单位内部。
用于估计个体间变异、效应与不确定性。
增加样本内测量精度，但不自动增加独立样本量。
Library 是第一次决定‘哪些分子能够被看见’
建库不是把样本原样装进测序仪。富集、片段化、接头、barcode、UMI 和 PCR 会定义后续数据的可见范围与偏倚。
阈值不是固定标准。先看数据分布、组织特性、测序深度、样本重复和研究问题。
Read、fragment、barcode、UMI 和 adapter 分别是什么？
read 是对文库片段的一端或两端进行有限长度读取的结果；不同 assay 会把技术标签和生物序列安排在不同位置。
Phred score 是错误概率模型，不是研究总评分
FASTQ quality string 为每个碱基编码一个质量估计。Q 值每增加 10，模型错误概率下降 10 倍。
Q = −10 log₁₀(Perror)
FASTQ 将序列与逐碱基质量编码放在同一记录中；Phred score 表示估计的 base-call error probability。
阈值不是固定标准。先看数据分布、组织特性、测序深度、样本重复和研究问题。
什么时候需要 trimming，而不是把它当成固定仪式？
短 insert、真实 adapter、低质量末端和 assay 结构决定是否需要处理；任何剪切都应记录前后 reads、长度和定位变化。
短 insert 才会让 read 进入 adapter
阈值不是固定标准。先看数据分布、组织特性、测序深度、样本重复和研究问题。
Alignment 的结果不是‘成功/失败’，而是 reads 去向的分解
同一条 read 可能唯一定位、对应多个位置、无法定位或因规则被过滤；总 mapping rate 会隐藏这些不同含义。
SAM/BAM 记录 reads 的定位、flags、CIGAR 与附加标签；“已比对”不是单一质量结论。
阈值不是固定标准。先看数据分布、组织特性、测序深度、样本重复和研究问题。
Reference genome 告诉你‘在哪里’，annotation 告诉你‘算作什么’
FASTA 定义参考序列和坐标；GTF/GFF 定义 gene、transcript、exon 等 feature。两者版本都能改变最终矩阵。
提供序列和坐标系
定义哪些坐标属于哪些 feature
产生可建模的 feature count
阈值不是固定标准。先看数据分布、组织特性、测序深度、样本重复和研究问题。
同一项目中的文件和矩阵回答不同问题
从物理样本到数值矩阵，每一步的对象类型、shape、分母和科学含义都在变化。
更深测序什么时候仍有收益，什么时候主要是在重复？
测序深度、文库复杂度、低丰度目标和独立样本数共同决定资源配置；不存在跨 assay 的万能 reads 数。
阈值不是固定标准。先看数据分布、组织特性、测序深度、样本重复和研究问题。
多样本 QC 应寻找跨 sample、lane 和 run 的结构，而不是只看单个绿色或橙色图标。
一张 Sequencing QC Figure 应怎样被逆向阅读？
切换 A–D Panel，从每周期质量、adapter、reads 去向和 count matrix 反向追踪到 FASTQ、文库与独立样本。
From sequencing run to an analysis-ready matrix
MedResearch Atlas Teaching Dataset · paired-end RNA library · Figure 1
测序参数必须放回 assay、样本与下游目标中判断
read length、insert size、Q30、深度、重复、mapping 与注释版本都没有脱离上下文的唯一正确值。
测序基础最常见的 8 个推理错误
问题往往不是软件没运行，而是把技术观测、独立样本、特征定义和生物学结论混在了一起。
Sequencing QC 可以支持什么，不能证明什么？
高质量 reads 是可靠分析的必要条件之一，却从来不是研究设计、机制或因果成立的充分条件。
结果可以支持什么？
样本已经产生可读取且可追溯的序列数据
特定 cycle 的 base calling 质量与错误概率估计
文库片段长度、接头、复杂度和重复模式
reads 相对指定 reference 与 annotation 的定位结果
从 FASTQ 到 feature matrix 的计算转换和数据损失
为特定 assay 的下游分析提供质量与可用性依据
不能单独证明什么？
患者分组没有偏倚或混杂
建库无偏地保留了样本中的所有真实分子
高测序深度等于高独立样本量
高 Q30 或高 mapping rate 等于生物学结论正确
检测到某个序列就证明其具有机制或因果作用
一次测序 run 可以替代独立实验和正交验证
用五道判断题检查测序科研思维
重点是判断统计单位、质量层级、reads 去向、深度收益和 reference/annotation，而不是背软件参数。
某研究有 4 位患者，每位获得约 5000 万条 reads。进行组间推断时，最合理的独立样本量理解是什么？
一个样本 Q30 为 94%，最稳妥的结论是什么？
总 mapping rate 为 96%，下一步最重要的追问是什么？
增加测序深度时新检测到的分子迅速减少，duplicate rate 持续上升，最合理的下一步是什么？
同一批 FASTQ 使用不同 GTF 后基因计数发生变化，最合理的解释是什么？
把样本、reads、矩阵和证据压缩成一条可追溯链
任何 Figure 都应能反向追到统计结果、矩阵、比对记录、FASTQ、文库和独立样本。
Data
数据怎样产生与变化
Method
每一步为什么存在
Figure
结果怎样被看见
Evidence
结论能够走多远
参考与数据声明
本页全部 reads、质量、比对比例、矩阵与复杂度曲线均为固定规则生成的原创教学模拟，不代表真实患者或测序 run。不同平台、物种、建库策略和 assay 的预期分布不同，应以对应实验方案和官方技术文档为准。
参考文献与进一步阅读
References 支撑本章论断；Further Reading 负责下一步学习。两者不混为一谈。
文件格式与质量模型
支撑 FASTQ、Phred、SAM/BAM 和多样本 QC 的正式定义。
The Sanger FASTQ file format for sequences with quality scores, and the Solexa/Illumina FASTQ variants
Peter J. A. Cock et al.. Nucleic Acids Research, 2010.
为什么推荐：FASTQ 格式与质量编码。
DOI 10.1093/nar/gkp1137 PMID 20015970 PMC2847217 查看原文Base-calling of automated sequencer traces using phred. II. Error probabilities
Brent Ewing, Phil Green. Genome Research, 1998.
为什么推荐：Phred error probability。
PMID 9521922 查看原文The Sequence Alignment/Map format and SAMtools
Heng Li et al.. Bioinformatics, 2009.
为什么推荐：SAM/BAM format 与 SAMtools。
DOI 10.1093/bioinformatics/btp352 PMID 19505943 PMC2723002 查看原文MultiQC: summarize analysis results for multiple tools and samples in a single report
Philip Ewels, Måns Magnusson, Sverker Lundin, Max Käller. Bioinformatics, 2016.
为什么推荐：跨工具、多样本 QC 汇总。
DOI 10.1093/bioinformatics/btw354 PMID 27312411 PMC5039924 查看原文官方规范与文档
格式、QC 模块和公共归档规则随版本变化，应优先查官方来源。
FastQC: A Quality Control Tool for High Throughput Sequence Data
Simon Andrews, Babraham Bioinformatics. Official project documentation.
为什么推荐：FastQC 模块的官方解释。
查看原文GA4GH SAM/BAM and Related Specifications
Global Alliance for Genomics and Health, SAM/BAM Format Specification Working Group. Official format specifications.
为什么推荐：SAM/BAM/CRAM 等正式规范。
查看原文