Bulk RNA sequencing
Bulk RNA 测序
从独立生物学样本的 RNA 计数出发，理解样本整体转录状态如何变成可检验、可追溯且边界清楚的组间证据。
学完这一章，你应该能够
点击勾选不是“完成任务”，而是对自己的理解做一次承诺。
Bulk RNA-seq 测量的究竟是什么？
它把一个独立样本中的 RNA 汇总成组织或培养体系的平均转录状态，适合比较样本，而不直接解析细胞身份。
把每份组织想成一支合唱团。Bulk RNA-seq 记录整支合唱团的声音强弱，能比较两场演出是否不同，但不能仅凭录音指出是哪位成员改变了音量。
Bulk RNA-seq quantifies transcript abundance from pooled RNA within each biological sample. The independent sample—not each read—is the statistical unit.
每个基因得到一个组织平均表达量
适合比较样本与组别；不能单独定位变化来自哪类细胞。
独立生物学重复决定组间推断；增加 reads 不能替代增加独立样本。
一份组织，怎样变成可检验的差异表达结果？
点击任意节点，追踪它为什么存在、接收什么、产生什么，以及错误会怎样沿数据链传递。
Tissue
组织样本
研究问题必须首先对应到明确的人群、组织和比较。
研究问题必须首先对应到明确的人群、组织和比较。
患者或模型来源的组织
按纳排标准、时间点和组织区域采集并记录 metadata。
可追溯的生物学样本
同一个项目里，数据对象在不断变化
FASTQ、BAM、count matrix、design matrix 与 DE table 各自承载不同信息，不能互相替代。
Reads 与比对 QC：warning 不是自动失败
先明确指标对应哪一层过程，再结合建库类型、参考序列和组间分布解释异常。
阈值不是固定标准。先看数据分布、组织特性、测序深度、样本重复和研究问题。
样本级 QC：寻找结构，而不是寻找可删的点
文库大小、检测基因数、相关性、PCA、批次与临床元数据要联合判断。
归一化解决可比性，design formula 定义比较
两者都发生在差异表达之前，但回答的是不同问题：如何比较数值，以及究竟比较什么。
离散计数保留抽样过程，适合 count-based DE 模型；文库深度尚不可直接比较。
同一患者治疗前后各有一个样本
配对设计：~ patient + time患者基线差异应作为配对结构控制，而不是把 20 个样本当作 20 个独立个体。
PCA 用于诊断全局结构，不是显著性检验
每个点必须代表独立生物学样本；颜色、形状和标签应同时编码 condition、batch 与关键协变量。
差异表达：效应量与不确定性必须一起读
P 值回答数据与零假设的相容程度；log2FC 回答变化方向和大小；FDR 控制大规模检验中的预期错误发现比例。
“显著”不能替代科学判断
同时检查效应量、FDR、独立样本一致性、表达丰度与预先定义的 contrast。
DESeq2 用负二项模型估计 count 数据的效应与离散度；大规模检验还需要控制 false discovery rate。
一张 Bulk RNA-seq Figure 是怎么读的？
依次选择 A–D Panel，先识别视觉编码，再反向追踪到设计、矩阵、FASTQ 与组织样本。
Transcriptomic signature of pulmonary fibrosis
MedResearch Atlas Teaching Dataset · 12 samples · Figure 3
八类常见 Bulk RNA-seq Figure
每张图只能回答一类问题；常见误读往往来自把探索图、统计结果和机制证据混为一谈。
Sample PCA
- 回答
- 哪些因素主导样本整体表达差异？
- 误读
- 视觉分离不是差异表达检验。
Sample Correlation
- 回答
- 样本整体表达模式是否一致或存在错标？
- 误读
- 高相关不代表没有系统偏差。
MA Plot
- 回答
- 效应量是否随平均表达水平出现系统偏倚？
- 误读
- 低表达区的大倍数变化通常不稳定。
Volcano Plot
- 回答
- 哪些基因同时有较大效应和统计证据？
- 误读
- 显著基因不是自动的机制基因。
Heatmap
- 回答
- 候选基因的模式是否跨独立样本一致？
- 误读
- 按行缩放的颜色不能比较基因间绝对表达。
GO / KEGG
- 回答
- 候选列表过度代表哪些已知功能？
- 误读
- 背景基因集错误会改变所有富集结论。
GSEA
- 回答
- 全基因排序中是否存在协调的通路变化？
- 误读
- 富集方向依赖 ranking 和表型编码。
Expression Boxplot
- 回答
- 预定义基因在每个样本中的分布如何？
- 误读
- 不能把 read 或技术重复当作生物学样本。
GO / KEGG 与 GSEA 使用的输入并不相同
前者通常从候选列表出发，后者从完整排序出发；两者都依赖注释数据库与明确的背景。
先定义候选基因列表
显著 DE genes 与可检测背景基因集比较，回答“列表是否过度包含某类注释”。
结果仍是注释关联
依赖候选阈值和背景基因集。 富集不是通路功能已被实验激活的证明。
GSEA 从完整排序列表检验 gene set 的集中趋势；富集结果仍是计算关联。
这一章最重要的参数与设计选择
参数不是软件默认值清单。打开每一项，检查调高、调低会改变什么，以及判断必须依赖哪些证据。
初学者最常见的 8 个错误
从 Error 到 Consequence，再到 Better Thinking，理解错误为什么会改变可解释的证据。
转录差异可以支持什么，不能证明什么？
把组织平均表达关联停在它能够到达的位置，再用细胞定位和功能实验推进证据层级。
结果可以支持什么？
疾病组与对照组在样本平均表达上存在差异
某些基因集与疾病状态呈协调关联
候选分子信号可在独立样本中复核
为单细胞定位或实验干预提出候选假设
不能单独证明什么？
差异基因来自哪一种细胞类型
某基因导致疾病发生
富集通路已经在功能上被激活
一个显著基因就是治疗靶点
组间差异已经排除所有混杂和批次
不要背流程，做五个科研判断
提交后不仅查看正确答案，还要解释其他选项为什么会破坏设计、输入或证据边界。
病例与对照样本完全分布在不同建库批次，最稳妥的判断是？
为什么 DESeq2 / edgeR 通常需要 raw counts，而不是 TPM？
PCA 中疾病组与对照组明显分开，最合理的下一步是？
GSEA 显示 ECM pathway 在疾病组正向富集，可以直接得出什么？
一个基因 FDR=0.001 但 log2FC=0.08，最稳妥的解释是？
把完整证据链压缩成一张图
回看 Data、Method、Figure 与 Evidence：任何结论都应该能够沿链条反向追溯。
Data
数据怎样产生与变化
Method
每一步为什么存在
Figure
结果怎样被看见
Evidence
结论能够走多远
参考与数据声明
本页全部数值与 Figure 均为固定种子生成的原创教学模拟，不承载真实患者或研究结论。未来引用真实论文 Figure 时必须记录开放许可、作者与原始链接。
参考文献与进一步阅读
References 支撑本章论断；Further Reading 负责下一步学习。两者不混为一谈。
核心方法与统计
支撑比对、差异表达、多重检验与基因集富集。
STAR: ultrafast universal RNA-seq aligner
Alexander Dobin et al.. Bioinformatics, 2013.
为什么推荐：splice-aware RNA-seq alignment。
DOI 10.1093/bioinformatics/bts635 PMID 23104886 PMC3530905 查看原文Moderated estimation of fold change and dispersion for RNA-seq data with DESeq2
Michael I. Love, Wolfgang Huber, Simon Anders. Genome Biology, 2014.
为什么推荐：负二项差异表达模型。
DOI 10.1186/s13059-014-0550-8 PMID 25516281 PMC4302049 查看原文Controlling the False Discovery Rate: A Practical and Powerful Approach to Multiple Testing
Yoav Benjamini, Yosef Hochberg. Journal of the Royal Statistical Society: Series B, 1995.
为什么推荐：FDR 控制的原始方法。
DOI 10.1111/j.2517-6161.1995.tb02031.x 查看原文Gene set enrichment analysis: a knowledge-based approach for interpreting genome-wide expression profiles
Aravind Subramanian et al.. Proceedings of the National Academy of Sciences, 2005.
为什么推荐：基于排序列表的 gene-set enrichment。
DOI 10.1073/pnas.0506580102 PMID 16199517 PMC1239896 查看原文流程与实验设计
支撑从样本、QC 到建模与解释的整体方法。
A survey of best practices for RNA-seq data analysis
Ana Conesa et al.. Genome Biology, 2016.
为什么推荐：完整 RNA-seq 分析综述。
DOI 10.1186/s13059-016-0881-8 PMID 26813401 PMC4728800 查看原文How many biological replicates are needed in an RNA-seq experiment and which differential expression tool should you use?
Nicholas J. Schurch et al.. RNA, 2016.
为什么推荐：生物学重复与检测性能 benchmark。
DOI 10.1261/rna.053959.115 PMID 27022035 PMC4878611 查看原文