Single-cell RNA sequencing
单细胞 RNA 测序
不再测量一块组织的“平均表达”，而是分别观察成千上万个细胞的转录状态。
学完这一章，你应该能够
点击勾选不是“完成任务”，而是对自己的理解做一次承诺。
一份组织，是怎么变成 UMAP 的？
点击任意节点，追踪它的输入、输出、参数、QC 和下一步。
QC
细胞质量控制
坏细胞和 doublet 也会进入矩阵，并可能制造假 cluster 或 marker。
坏细胞和 doublet 也会进入矩阵，并可能制造假 cluster 或 marker。
Gene × Cell Matrix
联合观察基因数、UMI、线粒体比例、doublet 与样本分布。
保留的高可信细胞
UMI：从 duplicate reads 回到原始分子计数
4 个最初被捕获的 RNA 分子；我们关心的计数从它们开始，而不是从测序仪输出开始。
先观察 4 个被捕获的 RNA 分子如何获得不同 UMI，再看 PCR 将每个模板复制成多条 reads，最后按 cell barcode、gene 与 UMI 的组合折叠候选技术重复。
原创教学交互 · 模拟数据 · 未复制论文 Figure解释 UMI 为什么能帮助识别同一捕获分子的 PCR copies，并说明 reads 计数与 UMI-collapsed count 的区别。
不能证明 UMI count 等于样本中的绝对 RNA 分子数；未捕获分子、UMI collision、测序错误与饱和仍会造成偏差。
PCR：为什么 reads 会指数增加，原始分子却没有增加
这是理想化的倍增示意。真实 PCR 会受到扩增效率、饱和与序列偏好和随机性影响，并不保证每轮精确翻倍。
理想化展示一个模板经过多轮 PCR 后形成 1→2→4→8→16→32 条 copies，并把 reads/copies 计数与原始 RNA 分子计数并列，突出两者的分叉。
原创教学交互 · 模拟数据 · 未复制论文 Figure解释 PCR amplification 如何从同一模板产生大量 reads，以及为何重复 reads 不能当作独立原始分子。
不能证明真实 PCR 每轮精确翻倍，也不能由 reads 数单独推出绝对表达量；扩增效率、饱和与序列偏好需要额外 QC。
为什么需要单细胞？
同一块组织中的细胞并不相同。首先理解 Bulk 与单细胞究竟在测量什么。
Bulk RNA-seq 像把一个班级所有人的声音混在一起录音；单细胞测序则尝试分别记录每个人说了什么。
Single-cell RNA sequencing quantifies transcript abundance in individual cells, enabling analysis of cellular heterogeneity that is obscured by pooled measurements.
所有细胞的信号被混合
“这一块组织发生了变化。”
每个细胞有独立表达谱
“究竟是哪一类细胞发生了变化？”
数据在不断变成什么？
同一个项目会依次产生文件、矩阵、图结构、标签和二维坐标；它们不是同一种东西。
从 到表达矩阵，数据对象的结构和能够回答的问题都在改变。
QC：哪些细胞应该留下？
质量控制不是套用三个阈值，而是判断哪些观测仍能可信代表生物学。
阈值不是固定标准。先看数据分布、组织特性、测序深度、样本重复和研究问题。
QC 应结合分布、组织背景和多个指标判断，固定阈值不能跨数据集自动迁移。
Normalization → HVG → PCA
从 raw counts 到可比较的细胞表示，每一步都在处理一个具体问题。
不是差异表达基因，而是用于建立细胞表示的特征集合。
Raw Matrix
深浅同时受到真实表达与测序深度影响。
PCA → Neighbors → Cluster / UMAP
这是单细胞分析最容易被教程步骤掩盖、却最重要的结构关系。
同一个 neighbor structure，两种不同输出。 聚类回答“如何分组”，UMAP 回答“如何把局部关系画出来”。
UMAP 负责低维表示；Leiden 在邻居图上发现社区。两者共享上游表示，但回答的问题不同。
resolution 会改变什么？
不要只数 cluster：比较相邻档位的细胞去向、marker、样本组成与 QC 证据，判断新增切分是否值得保留。
0.8 → 1.2
选择右图中的 cluster，左图会定位其主要父群；下方同时更新 marker、样本组成、QC 与停止判断。
- 相邻分群 NMI
- 0.73标签一致性，不是生物学真值
- 发生显著拆分的父群
- 3子群占父群 ≥10%
- 保留在主去向的细胞
- 84%越低说明换群越剧烈
连线比例是细胞重叠，不是发育轨迹，也不代表真实时间方向。
- nFeature median
- 65
- nCount median
- 109
- percent.mt median
- 2.4%
停止提高并回退
这个新群主要呈现极小群或 QC 驱动特征；不能因为二维图上分开就命名为新细胞类型。
3 cells；极小群首先考虑不稳定切分。
IL7R: logFC 3.80，表达比例差 75%。
单一样本最高占比 67%。
模拟低质量细胞占比 0%，percent.mt 中位数 2.4%。
3 个主要父群；主父群贡献 33%。
什么时候应该停止继续提高 resolution？
不是达到某个固定数字就停止，而是新增切分不再带来稳定、可重复、能回答问题的证据时停止。
相邻档位、随机种子或重采样后，这个群还存在吗？
停止信号：轻微变化就消失、合并或大量换群。是否存在成套正/负 marker，并在独立样本复现？
停止信号：只有单个弱基因，或主要是 MT、核糖体、应激信号。新群是否由多个生物学重复共同贡献？
停止信号：几乎只来自单一样本、批次或低质量细胞。它是否改善身份、状态或组间比较的可解释性？
停止信号：只是看起来更细，却没有新的可检验问题或验证方案。从 Cluster 到 Cell Type
聚类只产生编号；细胞身份来自 marker、参考图谱、文献和组织背景的联合判断。
Reference atlas
Known markers
Literature + tissue
注释是证据整合，不是自动命名。 单个 marker 可能共享表达或只反映瞬时状态。
一张单细胞 Figure 是怎么读的？
选择 Panel，先读视觉编码，再追溯输入数据和证据边界。
Cellular landscape of pulmonary fibrosis
MedResearch Atlas Teaching Dataset · 2026 · Figure 2
真实数据通常具有不规则流形、群体大小差异、连续 QC 梯度和更拥挤的多 Panel 编排。以下原图不替代论文上下文。
真实论文 Figure · 保留原图与完整归属
这里用于训练读图，不把论文图改写成本站的研究结果。所有图片均来自 PMC Open Access Subset，并逐张核验 CC BY 4.0。
打开本地高清图本地副本与修改说明
- Publisher-provided large image saved locally
- Responsive display only; panel content was not altered
八类常见单细胞 Figure：如何读，何时停
逐类拆解视觉编码、读图顺序、可信趋势和失败信号；一张图只有通过样本重复、QC 与证据边界检查，才值得继续解释。
不要先看结论，先建立固定读图顺序
- 1 轴与编码
- 2 全局结构
- 3 组间趋势
- 4 重复与 QC
- 5 证据边界
主要细胞状态如何组织，样本与批次是否共同覆盖这些状态？
按这个顺序读，不要跳步
- 01先看图例确认颜色代表 cluster 还是 sample，确认是否展示全部细胞及各组细胞数。
- 02再看全局结构识别大群、连续过渡、稀有小群和离群岛，但暂不命名细胞类型。
- 03改按样本着色可信群体通常由多个生物学重复共同贡献；若一座岛几乎来自单一样本，先怀疑批次或样本特异质量。
- 04叠加 QC 与 marker检查小群是否高 percent.mt、低 nFeature，或是否拥有成套正 marker 与负 marker。
- 05回到邻居图聚类来自 neighbor graph，不在二维 UMAP 上按视觉距离手工圈群。
- 主要群体包含多个样本，样本在同一生物状态内充分混合，但已知真实条件差异不被强行抹平。
- 群体边界能被成套 marker、参考图谱和组织知识重复支持，而不只靠岛屿外形。
- 调整随机种子、邻居数或 UMAP 参数后，全局结论仍大体稳定。
- 稀有群具有足够细胞、跨重复出现，并且没有明显低质量或 doublet 特征。
- 不同样本各自形成独立岛屿，或某个 cluster 超过绝大多数细胞来自单一样本。
- 所谓新群同时呈现两种互斥谱系 marker，且 nCount 异常高，提示 doublet。
- 小岛只由少量高 percent.mt、低 nFeature 细胞构成，提示受损细胞或环境 RNA。
- 仅凭二维靠得近就推断细胞相互作用、发育先后或空间邻近。
支持描述数据中的表达状态结构、候选细胞群及其样本构成，并为 marker 和下游检验定位对象。
不能单独证明细胞谱系、组织空间距离、细胞通讯、疾病机制或因果关系。
什么时候应该停止解释？若把颜色切换为 sample 后群体结构完全被样本来源替代，先暂停生物学命名，回查批次、QC、整合策略与样本量。
不要只列指标：把证据放回一个判断情境
先用类比建立直觉，再把每项观察放回研究问题，最后决定结论应该停在哪里。
UMAP 像一张带图例的地图
地图不是目的地本身，它只把位置、方向和比例编码出来。读 UMAP 时，先确认每个视觉元素代表什么，再判断哪些趋势可以支持研究问题。
这张 UMAP 真正要回答什么？
情境：研究者用 预处理后的研究数据和样本 metadata 生成 UMAP，想回答“主要细胞状态如何组织，样本与批次是否共同覆盖这些状态？”。
问题：图中的趋势是否在正确的统计单位、样本和不确定性范围内成立？
观察：先观察整体结构，再核对图例、分母、重复和异常点；任何单一视觉趋势都必须回到生成它的数据对象。
先确认 先看图例 编码的是什么
确认颜色代表 cluster 还是 sample，确认是否展示全部细胞及各组细胞数。
主要群体包含多个样本，样本在同一生物状态内充分混合，但已知真实条件差异不被强行抹平。
不同样本各自形成独立岛屿，或某个 cluster 超过绝大多数细胞来自单一样本。
没有 先看图例 时，不能判断图形变化是生物学趋势还是编码、分母或样本差异造成的。
如果 先看图例 清楚且与其他层证据方向一致，UMAP 才能回答“主要细胞状态如何组织，样本与批次是否共同覆盖这些状态？”的一部分；不要跳过样本层复核。
先拆解编码，再看趋势，最后把趋势与样本、效应量和不确定性合并；图形美观不能替代统计与实验设计。
支持描述数据中的表达状态结构、候选细胞群及其样本构成，并为 marker 和下游检验定位对象。
不能单独证明细胞谱系、组织空间距离、细胞通讯、疾病机制或因果关系。
什么时候应该停止继续解释？
若把颜色切换为 sample 后群体结构完全被样本来源替代，先暂停生物学命名，回查批次、QC、整合策略与样本量。
- 不同样本各自形成独立岛屿，或某个 cluster 超过绝大多数细胞来自单一样本。
- 所谓新群同时呈现两种互斥谱系 marker，且 nCount 异常高，提示 doublet。
- 小岛只由少量高 percent.mt、低 nFeature 细胞构成，提示受损细胞或环境 RNA。
读图判断应回到生成图形的数据对象、样本重复和分析假设；低维结构本身不能替代统计检验与生物学验证。
完成 Cell Annotation 之后还能做什么？
高级分析不是“软件功能菜单”，每个分支都应由一个具体科研问题启动。
这一章最重要的参数
点击参数条目查看向上或向下调整的影响，以及真正应该结合哪些证据。
初学者最常见的 8 个错误
错误本身不可怕；关键是理解它会怎样改变结果，以及更好的判断方式是什么。
这个结果能证明什么？
科学解释的质量，取决于你是否知道结论应该停在哪里。
结果可以支持什么？
不同细胞群存在表达差异
某些基因富集于特定细胞类型
某些细胞状态与疾病状态相关
为机制实验形成可检验假设
不能单独证明什么？
某基因导致疾病
配体受体预测一定代表真实通讯
pseudotime 就是真实细胞演化时间
UMAP 中相邻 cluster 存在直接关系
差异表达基因就是治疗靶点
单细胞分析可以提出细胞状态、组成和通路关联，但机制与因果需要独立验证设计。
现在轮到你
把知识重新排列为一条能回答真实科研问题的数据链。
候选基因 X 主要由哪一类细胞表达？
请把分析步骤排列成一条能够回答问题的数据链。
科研思维 Quiz
这些题不考缩写，而是检查你能否选出证据边界内最合理的解释。
疾病组某个 fibroblast cluster 比例增加，哪个结论最合理？
为什么 raw counts 不应直接用于 UMAP？
PCA、Neighbors、Clustering 和 UMAP 的正确关系是？
提高 resolution 后出现更多 cluster，下一步最合理的是？
pseudotime 最稳妥的解释是？
把这一章压缩成一张图
从组织到问题，记住数据、方法、Figure 和证据四个维度。
Data
数据怎样产生与变化
Method
每一步为什么存在
Figure
结果怎样被看见
Evidence
结论能够走多远
本页图表为固定随机种子生成的原创模拟数据，只用于解释数据结构和分析关系，不承载真实生物学结论。具体实验与分析参数应结合组织、平台、样本质量与研究问题确定。
参考文献与进一步阅读
References 支撑本章论断；Further Reading 负责下一步学习。两者不混为一谈。
核心方法论文
支撑降维、聚类与主要分析框架的原始方法来源。
Comprehensive Integration of Single-Cell Data
Tim Stuart et al.. Cell, 2019.
为什么推荐：Seurat integration 与 anchor 框架。
DOI 10.1016/j.cell.2019.05.031 PMID 31178118 PMC6687398 查看原文SCANPY: large-scale single-cell gene expression data analysis
F. Alexander Wolf, Philipp Angerer, Fabian J. Theis. Genome Biology, 2018.
为什么推荐：Python 单细胞分析框架。
DOI 10.1186/s13059-017-1382-0 PMID 29409532 PMC5802054 查看原文UMAP: Uniform Manifold Approximation and Projection
Leland McInnes, John Healy, Nathaniel Saul, Lukas Großberger. Journal of Open Source Software, 2018.
为什么推荐：UMAP 的算法目标与可视化边界。
DOI 10.21105/joss.00861 查看原文From Louvain to Leiden: guaranteeing well-connected communities
Vincent A. Traag, Ludo Waltman, Nees Jan van Eck. Scientific Reports, 2019.
为什么推荐：基于邻居图的 Leiden 社区发现。
DOI 10.1038/s41598-019-41695-z PMID 30914743 PMC6435756 查看原文实验与软件官方文档
用于核对当前 pipeline、cell calling 与输出对象定义。
QC 与最佳实践
说明 QC、归一化、聚类和注释为什么必须依赖数据情境。
Current best practices in single-cell RNA-seq analysis: a tutorial
Malte D. Luecken, Fabian J. Theis. Molecular Systems Biology, 2019.
为什么推荐：教程型 best practices。
DOI 10.15252/msb.20188746 PMID 31217225 PMC6582955 查看原文miQC: An adaptive probabilistic framework for quality control of single-cell RNA-sequencing data
Ariel A. Hippen et al.. PLOS Computational Biology, 2021.
为什么推荐：真实 QC 联合分布、概率过滤与群体组成影响。
DOI 10.1371/journal.pcbi.1009290 PMID 34428202 PMC8415599 查看原文真实 Figure 来源
页面内嵌 CC BY 真实论文 Figure 的论文级来源与教学用途。
miQC: An adaptive probabilistic framework for quality control of single-cell RNA-sequencing data
Ariel A. Hippen et al.. PLOS Computational Biology, 2021.
为什么推荐：Fig. 1 与 Fig. 5：真实 QC 分布和不规则 UMAP。
DOI 10.1371/journal.pcbi.1009290 PMID 34428202 PMC8415599 查看原文